Противовирусные свойства широкого спектра действия ivepмектина, полезные для лечения C19

Вирусы, такие как цитомегаловирус человека (HCMV), вирус папилломы человека (HPV), вирус Эпштейна – Барра (EBV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и к0р0навирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома [SCoV2]) представляют собой отличные вирусы и бремя для здоровья человека во всем мире. Одобренный FDA антипаразитарный препарат ivepмектин)иве) также является антибактериальным, противовирусным и противоопухолевым средством, которое предлагает больше возможностей для улучшения здоровья населения во всем мире и может эффективно подавлять репликацию SCoV2 in vitro. Это исследование было направлено на выявление изменений пути инфицирования иве вируса в раковых клетках яичников человека. Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC). Количественная протеомика была использована для анализа клеток рака яичников человека TOV-21G, обработанных иве (20 мкмоль / л) и без него в течение 24 часов. которые идентифицировали 4447 иве-связанных белков в раковых клетках яичников. Анализ сети путей выявил четыре статистически значимых противовирусных пути, включая пути инфицирования HCMV, HPV, EBV и HIV1. Интересно, что по сравнению с сообщенными 284 генами, связанными с SCoV2 / C19 из GencLip3, мы выявили 52 изменения белков, связанных с SCoV2 / C19, при лечении с иве и без него. Белково-белковая сеть (PPI) была построена на основе взаимодействий между 284 генами, связанными с SCoV2 / C19, и между 52 белками, связанными с SCoV2 / C19, регулируемыми иве. Анализ молекулярного комплекса сети PPI выявил три узловых модуля, включая семейство цитокинов и факторов роста, киназу MAP и семейство G-белков, а также белки класса HLA. Анализ генной онтологии выявил 10 статистически значимых клеточных компонентов, 13 молекулярных функций и 11 биологических процессов. Эти результаты демонстрируют противовирусное свойство широкого спектра действия иве, полезного для лечения C19 в контексте прогнозирующей, профилактической и персонализированной медицины при заболеваниях, связанных с вирусами.

Мы сосредоточили наше внимание на путях, связанных с вирусами, таких как инфекция HCMV, инфекция HPV, инфекция EBV и инфекция HIV1. Что еще интереснее, Сообщалось, что большое количество идентифицированных белков связано с SCoV2 / C19. Эти результаты показали, что иве может быть противовирусным препаратом широкого спектра действия. Количественная протеомика SILAC доказала молекулярные механизмы иве в вирусных путях. Кроме того, модули концентраторов на основе белок-белкового взаимодействия (PPI) для белков, связанных с SCoV2, обнаружили ключевую молекулу в заболевании C19 в контексте прогнозирующей, профилактической и персонализированной медицины (PPPM) в C19.

Обработка ивер клеток, меченных SILAC

Наше предыдущее исследование показало, что, когда клетки TOV-21G обрабатывали иве (0-60 мкМ) в течение 24 часов, IC 50 составлял 22,54 мкМ для иве, а также 20 мкМ иве (он был меньше, чем IC 50 22,54 мкМ) значительно подавлял. пролиферация клеток и миграция TOV-21G и поддержание клеток TOV-21G в хорошей форме (N. Li & Zhan,  2020 ). Таким образом, клетки TOV-21G, культивированные в среде, меченной H- и L-стабильными изотопами, обрабатывали 20 мкМ иве в диметилсульфоксиде (ДМСО) или тем же количеством ДМСО, что и в контроле, в течение 24 часов. Обработанные иве клетки TOV-21G центрифугировали (800 г), промывали PBS (× 3), а затем суспендировали (30 мин, 4 ° C) в буфере для выделения белка [7 М мочевина, 2 мМ тиомочевина, 4% CHAPS (3 - [(3-холамидопропил) -диметиламмонио] - 1-пропан), 100 мМ дитиотреитола (DTT) и 2% амфолита] с помощью вихря (× 5). Раствор экстрагированного белка центрифугировали (13000 g , 20 мин, 4 ° C). Супернатанты представляли собой образцы экстрагированного белка, концентрации белка в которых исследовали с помощью набора для двумерного количественного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Количественный протеомный анализ SILAC выявил противовирусные свойства широкого спектра иве.

Всего 4447 белков, связанных с иве, было идентифицировано в клетках рака яичников, обработанных и без иве с помощью количественной протеомики на основе SILAC (Таблица S1). Дальнейший анализ пути KEGG выявил четыре связанных с вирусом пути (таблица  1 ), включая HCMV (рисунок S1A), HPV (рисунок S1b), EBV (рисунок S1C) и ВИЧ1 (рисунок S1d) пути заражения, а также восемь путей заражения, связанных с бактериями ( Таблица  1 ), включая бактериальную инвазию эпителиальных клеток, инфекцию холерного вибриона, передачу сигналов эпителиальными клетками при инфекции Helicobacter pylori , патогенную Escherichia coliинфекция, шигеллез, инфекция сальмонеллы, легионеллез и инфекция иерсинии (Рисунок S2). Эти обогащенные пути показали, что иве является антибактериальным и противовирусным средством, и предоставили ключи к разгадке соответствующих механизмов действия иве.

 Следует обратить внимание на то, что те белки, которые регулируются иве SCoV2, расположены в центре сети PPI.

3.3 Изменения клеточных процессов 52 белков, связанных с SCoV2, регулируемые иве

Обогащенный анализ генетической онтологии (GO) белков, связанных с SCoV2, регулируемых иве, позволил выявить множество изменений клеточных процессов (рисунок  2  и таблица S4), в том числе 11 статистически значимых BP, 10 клеточных компонентов (CC) и 13 MF. Анализ АД показал, что многие белки, связанные с SCOV2, были обогащены импортом белка, регуляцией метаболического процесса активных форм кислорода, пролиферацией мышечных клеток, положительной регуляцией связывания, взаимодействием с хозяином, клеточным ответом на липополисахарид, клеточным ответом на ион металла, положительная регуляция внутриклеточного транспорта белка, гомеостаз миелоидных клеток, гомеостаз ряда клеток и гомеостаз эритроцитов (рис.  2а).). CC-анализ показал, что многие белки, связанные с SCoV2, были обогащены кавеолой, ранней эндосомной мембраной, специфическим просветом гранулы, α-гранулой тромбоцитов, просветом α-гранулы тромбоцитов, гранулой, богатой фиколином-1, просветом гранулы, богатой фиколином-1, просвет эндосомы, ER, покрытый COPII, к транспортным пузырькам Гольджи и мембрана фагоцитарных пузырьков (рис.  2b). Анализ MF показал, что многие белки, связанные с SCoV2, были обогащены связыванием фосфопротеинов, негативной регуляцией связывания протеина, активностью липид киназы, регуляцией активности липидкиназы, позитивной регуляцией связывания, позитивной регуляцией связывания протеина, регуляцией связывания ДНК. , позитивная регуляция связывания ДНК, регуляция активности оксидоредуктазы, активность оксидоредуктазы, регуляция активности монооксигеназы, активность синтазы оксида азота и регуляция активности синтазы оксида азота (рис.  2c ).

Перекрытие 52 регулируемых иве белков SCoV2 среди связанных с вирусом путей

Перекрытие регулируемых иве белков, связанных с SCoV2, на пути, связанные с вирусом, было построено с помощью диаграмм Венна (рис.  3а). и Таблица S5), и четыре иве-регулируемых белка SCoV2 были идентифицированы среди этих пяти групп (EBV, HCMV, HIV, HPV и SCOV2), включая HLA-A, AKT1, NFKB1, и CASP3. Количественный протеомный анализ SILAC выявил широкий спектр противовирусных свойств иве, поэтому дальнейшее изучение перекрытия регулируемых иве белков, связанных с SCoV2, среди связанных с вирусом путей может быть важным. Из-за важности SCOV2 в настоящее время были также специально упомянуты специально связанные с SCoV2 белки, включая ZC3HAV1, ITPA, ALB, COPB2, IL1F10, KPNB1, SLTM, HMOX1, CTSB, IDH2, LIMS1, G6PD, UBL5, TGFB1, PML, IFITM3, CAV1, SARS, ITCH, MGMT, ATG5, HSPA4, SARS2, KPNA2, PRKAA1, ANPEP, APP, MB, BSG, TRPV1, IL18, TIMM8A, PPP1CA, HMGB1 и EEF1A2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Иве, как противопаразитарный препарат в течение длительного времени, оказался очень безопасным для высокоразвитых животных, потому что основным механизмом является нацеливание на хлорид-зависимые каналы как глутамата, так и γ-аминомасляной кислоты, которые прерывают нейротрансмиссию у беспозвоночных (животные с более низким уровнем развития). У человека существует гематоэнцефалический барьер, который может хорошо защищать центральную нервную систему (Develoux,  2004 ). Иве редко вызывает лекарственную устойчивость, и большинство побочных эффектов связано с высвобождением антигена, а не самого иве (Boussinesq,  2005).). Хорошая переносимость иве была показана даже у детей и младенцев. В общей сложности 170 младенцев и детей (вес <15 кг) получали иве перорально, и только у семи субъектов были зарегистрированы легкие, но не очень серьезные побочные эффекты (Levy et al.,  2020 ). При оценке существующих доказательств серьезных событий (мертворождение, самопроизвольные аборты, неонатальная смерть и врожденные аномалии) после воздействия иве у беременных женщин, 893 беременных женщины не сообщили о низкой массе тела при рождении, неонатальной смертности, преждевременных родах или материнской заболеваемости, которые указали на высокую безопасность иве, но это все еще было недостаточным доказательством, чтобы сделать вывод об определенной безопасности иве во время беременности (Nicolas et al.,  2020). Изучение фармакокинетики противопаразитарного препарата иве предоставило некоторые контрольные значения, которые могут быть полезны для иве, применяемого при других заболеваниях. Субъекты ( n  = 68) получали более высокие или более частые дозы, чем в настоящее время одобренные для использования людьми (наивысшая доза иве, одобренная FDA, составляет 200 мкг / кг). Результаты показали, что иве в целом хорошо переносился даже при 10-кратной максимальной дозе, одобренной FDA (2000 мкг / кг), и редко оказывался связанным с токсичностью для ЦНС. Кроме того, средняя площадь под кривыми соотношений составляла 1,24 и 1,40 для доз 30 и 60 мг соответственно, что указывает на минимальное накопление иве (Guzzo et al.,  2002). Большое количество пациентов, получавших иве, показали, что это безопасный и хорошо переносимый препарат. Это сделало иве более полезным для клинического применения.

Иве, по-видимому, стал основой для будущих разработок противовирусных средств, и во многих исследованиях сообщалось о широкой противовирусной активности иве. Например, иве вызвал снижение синтеза РНК вируса чикунгунья, а также подавление экспрессии вирусного белка, что повлияло на вирусный инфекционный цикл (Varghese et al.,  2016 ). Иве обладает ингибирующими свойствами в отношении ядерного транспорта и, как было доказано, является ингибитором широкого спектра действия импорта α / β из ядер через высокопроизводительный скрининг. Кроме того, иве был способен ингибировать репликацию ВИЧ-1 и вируса денге (Wagstaff et al.,  2012). Одно исследование также продемонстрировало, что лечение иве подавляет инфицирование вирусом псевдобешенства, нарушая синтез вирусной ДНК и производство потомства вируса в зависимости от дозы. В этом процессе на ядерную локализацию UL42 также влиял иве через нацеливание на сигнальные пути ядерной локализации (Lv et al.,  2018). В настоящем исследовании анализ пути KEGG показал четыре пути, связанные с вирусом, включая пути инфицирования HCMV, HPV, EBV и HIV1. Эти четыре иве-регулируемых вирусных пути в целом содержали 362 белка. Многие из этих белков были тесно связаны с последствиями вирусной инфекции. NFKB - это регулятор транскрипции, который активируется различными внутри- и внеклеточными стимулами, такими как ультрафиолетовое облучение, свободные радикалы, не содержащие оксидантов, цитокины и бактериальные или вирусные продукты. Белок ICP0 вируса простого герпеса, вирусная убиквитинлигаза E3, значительно подавлял опосредованную фактором некроза опухоли-α (TNF-α) активацию ядерного фактора-κB (NF-κB) путем связывания с субъединицами p65 и p50 NF-κB, которые может способствовать патогенезу и уклонению от иммунитета вируса простого герпеса (J. Zhang, Wang, Wang, & Zheng, 2013 ). DDX58 кодировал белок, содержащий мотивы белка РНК-геликаза-DEAD-бокс и домен рекрутирования каспазы. Он участвует в вирусной регуляции иммунного ответа и распознавания двухцепочечной РНК. Кроме того, DDX58 опосредует индукцию транскрипции других генов, происходящих от хозяина, и интерферонов типа I, что приводит к иммунопатологическим изменениям (Rehwinkel & Gack,  2020). EIF2AK2 кодирует серин / треониновую протеинкиназу, которая активируется аутофосфорилированием после связывания с дцРНК. Активированная форма кодируемого белка может фосфорилировать фактор инициации трансляции EIF2S1, который, в свою очередь, ингибирует синтез белка. EIF2AK2, как один из генов, стимулированных интерфероном I типа, проявляет важные биологические и иммунологические функции. При вирусных инфекциях EIF2AK2 ингибирует или способствует репликации вируса (Wei et al.,  2020). Что касается пути инфицирования HCMV, всего было идентифицировано 85 белков, связанных с иве. В предыдущих исследованиях сообщалось, что некоторые из них опосредованы иве. Например, иве индуцировал апоптоз эпителиальных клеток за счет потери митохондриальной перегрузки ионами кальция, потенциала митохондриальной мембраны и генерации активных форм кислорода. В качестве механистического подхода иве регулирует клеточные сигнальные пути, включая пути AKT, PI3K и MAPK (Lee et al.,  2019 ). Иве также регулирует остановку клеточного цикла в фазе G1 за счет подавления CCND1 и CDK4 для подавления роста клеток (Diao et al.,  2019). Что касается пути инфицирования ВПЧ, всего было идентифицировано 107 белков, связанных с иве. В предыдущих исследованиях сообщалось, что некоторые из идентифицированных и родственных белков опосредованы иве. Например, иве индуцировал апоптоз за счет подавления экспрессии BCL-2 и усиления экспрессии BAX, расщепленной полимеразы поли [АДФ-рибозы] и активности CASP3 (Deng, Xu, Long, & Xie,  2018 ). Иве снижает транскрипцию P-гликопротеина, связываясь с внеклеточным доменом EGFR, чтобы ингибировать активацию EGFR и его нижележащую передачу сигналов, а не путем прямого ингибирования активности P-гликопротеина (Jiang, Wang, Sun, & Wu,  2019). Что касается пути заражения EBV, всего было идентифицировано 79 белков, связанных с иве. В предыдущих исследованиях сообщалось, что некоторые из них опосредованы иве. Например, было доказано, что иве ингибирует ферменты синтазы оксида азота и циклооксигеназы-2 путем ингибирования фосфорилирования митоген-активированных протеинкиназ (MAPK8) после стимуляции клеток LPS (X. Zhang et al.,  2009 ). Иве может быть от противопаразитарного средства к репозиционированному антибактериальному, противовирусному и противоопухолевому препарату, потому что иве взаимодействует с многонаправленным, включая определенный эпигенетический дерегулятор SIN3A (Juarez, Schcolnik-Cabrera, & Dueñas-Gonzalez,  2018). Что касается пути инфицирования ВИЧ1, то в общей сложности идентифицирован 91 белок, родственный иве. В предыдущих исследованиях сообщалось, что некоторые из них опосредованы иве. Например, индуцированная иве аутофагия была связана со снижением экспрессии активированной P21 киназы 1 (PAK1) через путь деградации, опосредованный убиквитинированием (Dou et al.,  2016 ).

Из-за вспышки и пандемии SCoV2 весь мир обеспокоен этой чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения. Эпидемиологические исследования показали, что SCoV2 имеет быструю передачу, и было установлено, что каждая инфекция может привести к 1,4–3,9 новых инфекций, если не будут приняты профилактические меры (Benvenuto et al.,  2020 ). Вирус в основном распространяется при тесном контакте или через дыхательные пути. Многие исследователи доказали, что SCoV2 может связываться с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2), чтобы проникать в клетки человека (Letko, Marzi, & Munster,  2020 ). Иве, одобренный FDA противопаразитарный препарат, много раз упоминался в недавних исследованиях как ингибитор SCoV2 (Caly et al.,  2020). Иве опосредует импорт вируса, ингибируя импортин (IMPα / β1) и создавая кислую среду (Caly et al.,  2020 ). Caly et al. сообщили о 5000-кратном снижении уровней РНК SCoV2 между группой лечения иве (5 мкМ иве) и контрольной группой. IC 50 иве для SCoV2 была рассчитана примерно на 2,5 мкМ. Согласно предыдущим фармакокинетическим исследованиям на здоровых добровольцах, было показано, что разовые дозы иве до 120 мг оказались безопасными и хорошо переносимыми (Chaccour, Hammann, Ramón-García, & Rabinovich,  2020). В недавнем исследовании количественная трансатомика и протеомика на основе SILAC определили профиль сигнального пути клеточных ответов на инфекцию SCoV2 в клеточной линии эпителиальной карциномы толстой кишки человека, включая гликолиз, трансляцию, сплайсинг, протеостаз и синтез нуклеотидов (Bojkova et al. др.,  2020 ). В этом исследовании SILAC был использован для анализа линии клеток рака яичников человека TOV-21G. После 10 пассажей клетки TOV-21G обрабатывали иве 20 мкмоль / л в течение 24 часов. Интересно, что по сравнению с зарегистрированными генами, связанными с SCoV2 / C19, из GencLip3 ( n = 284), мы выявили 52 изменения белков, связанных с SCoV2 / C19, при лечении с иве и без него. Например, белок, кодируемый CD147 (BSG), также был членом суперсемейства иммуноглобулинов, и сообщалось о возможной прямой вирусной инвазии клеток-предшественников / стволовых клеток через CD147 (BSG; Ulrich & Pillat,  2020 ). RB1 был негативным регулятором клеточного цикла и первым обнаруженным геном-супрессором опухоли. Структурная гомология с SCoV1 показала, что SCoV2 может напрямую нарушать pRb. Учитывая выраженный воспалительный ответ и сильный окислительный стресс, вызванный SCoV2, следует в течение длительного времени отслеживать, будет ли SCoV2 связан с высоким канцерогенным риском (Alpalhão, Ferreira, & Filipe,  2020). Экспрессия повышенных уровней провоспалительных цитокинов была тесно связана с острым повреждением легких и патогенезом у пациентов, инфицированных SCoV, включая IL-1β, MCP-1, IL-6, TNF-α и TGF-β1 (He и др.,  2006 ). Наши данные также выявили, что иве регулирует ключевые интерлейкины в цитокиновом шторме, вызванном SCoV2, такие как TNFB1, IL18 и IL1F10. Иве, похоже, потенциально действует против новой к0р0навирусной инфекции. Мы представили механизмы иве, используемого при лечении инфекции SCoV2.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Это исследование, насколько нам известно, было первым, в котором с помощью количественного протеомного анализа SILAC были представлены пути, регулируемые иве, связанные с вирусами, которые выявили противовирусные свойства иве широкого спектра действия. Более захватывающим было то, что идентифицированные регулируемые иве белки включали некоторые зарегистрированные белки, связанные с SCoV2, и это могло помочь в использовании потенциальных биомаркеров, связанных с иве, и новых механизмов в лечении инфекции SCoV2. Комбинация иве с другими лекарствами может привести к более благоприятным прогнозам для пациентов с C19. Например, одно исследование выдвинуло гипотезу о том, что комбинация ГКХ и иве может оказывать последовательное и синергетическое действие при лечении C19 (Patrì & Fabbrocini,  2020). Мы ожидаем, что наши результаты помогут понять молекулярные механизмы, лежащие в основе иве, используемого для лечения инфекции SCoV2. Кроме того, наши результаты дают представление о разработке иве как варианта лечения C19 в контексте исследований и практики PPPM.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jcp.30055
Подписывайтесь на мою страницу, всегда последние РКИ, КИ, обзор мировой прессы, статьи и рекомендации о передовых методах лечения К19 : https://www.facebook.com/veniamin.zaycev/

Здесь собрано все, что будет вам интересно, все объяснено в закрепленном посте, там же есть и схема-таблица с алгоритмом и применении иве:
https://www.facebook.com/ashominfo

Группа в фб «Так победим!» все вопросы по иве и ранней терапии:
https://www.facebook.com/groups/293522279068895

Телеграм-канал «Так победим!» на случай потери связи, там публикуется то, что идет в ЖЖ и не всегда идет в ФБ:
https://t.me/takpobedimsvz

Чат по иве в телеграме:
https://t.me/takpobedi