budetlyanin108

Categories:

Мощный синергизм в подавление коронавирусной инфекции у трех веществ

Не так давно я вам рассказывал о бромелайне именно в этой его способности ингибировать экспрессию ACE-2 и TMPRSS2. Вчера я опубликовал исследование по такому же действию кверцетина. Таким образом синергизм этих трех молекул ивермектина, кверцетина и бромейлайна будет обладать мощным подавляющим действием против коронавируса. Хотел отметить одну внимательную читательницу, подругу и блюстителя здоровья Анастасия Веденская, которая все внимательно читает и действует и вчера мне прислала фото банок, которые ей пришли по почте, среди, которых была банка с Кверцетином+бромелайн и спросила: -Веня, я правильно купила? -Конечно!,- ответил я радостно, что без лишних вопросов она заказала это месяц назад и сегодня сидит довольная. 

Бромелайн - это цистеиновая протеаза, выделенная из стебля ананаса, и используется в качестве пищевой добавки для лечения пациентов с болью, воспалением, 5 тромбозом, 6 и раком. 7
Недавно исследования показали, что гомотримерный вирусный спайк-белок (S1) SARS-CoV-2 связывается с трансмембранной сериновой протеазой 2 (TMPRSS2), примированной рецептором клетки-хозяина ACE-2 для первоначального входа с последующим слиянием мембран, опосредованным S2. 8 Из нескольких протестированных нормальных и раковых клеток клетки VeroE6 и Calu-3 показали экспрессию белка ACE-2 (рис.  1A ), а также базальный уровень белка TMPRSS2 (рис.  1B ). Поскольку ACE-2 9 и TMPRSS2 (UniProtKB-O15393) содержат остатки цистеина с дисульфидными связями для стабилизации структуры белка, мы исследовали влияние бромелаина на экспрессию ACE-2 и TMPRSS2. Бромелайн индуцировал зависимое от дозы и времени снижение экспрессии ACE-2 и TMPRSS2 в клетках VeroE6 (рис.  1C и D), но не изменяют экспрессию ACE-2 в клетках Calu-3 (Fig.  1E ). Однако бромелайн снижает экспрессию TMPRSS2 в Calu-3 (рис.  1E ) и ACE-2-отрицательных нормальных клетках бронхиального эпителия (BEAS-2B) и аденокарциномы легкого (A549) (рис.  1F и G ). Обработка ингибитором цистеиновой протеазы (E-64) дополнительно подтвердила, что активность цистеиновой протеазы бромелаина может расщеплять / снижать экспрессию ACE-2 и TMPRSS2 (рис.  1H ). Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) показал, что очищенный S-эктодомен SARS-CoV-2 связывается с ACE-2 в зависимости от концентрации и имеет сродство связывания, сравнимое с контрольным RBD (рис.  1I).). Расчетная молекулярная масса очищенного белка S-эктодомена-GFP составляет ~ 165 кДа; однако мы наблюдали более высокую молекулярную массу S-эктодомена (~ 215 кДа), что может быть связано с тяжелым N- и O-связанным гликозилированием ( намерение Fig.  1I ). Серологический анализ показал значительно увеличенную среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) очищенного S-эктодомена в образцах пациентов с положительной реакцией на COVID-19 (рис.  1J ). Эти два результата показали, что очищенный S-эктодомен является правильно свернутым и функционально активным белком.
образРИСУНОК 1Открыть в программе просмотра рисунковСиловая установкаБромелайн подавляет экспрессию ACE-2 и TMPRSS2. (A и B) Иммунологическое исследование экспрессии ACE-2 и TMPRSS2 в различных нормальных и раковых клетках. (C и D) Иммуноблоттинг ACE-2 и TMPRSS2 в клетках VeroE6, обработанных различной дозой (19, 37 и 75 мкг / мл в течение 48 часов) и времени (75 мкг / мл в течение 1–4 часов), соответственно. (E) Иммуноблоттинг ACE-2 и TMPRSS2 в клетках Calu-3, обработанных различной дозой (19, 37 и 75 мкг / мл в течение 48 часов). (F и G) Иммуноблоттинг TMPRSS2 в клетках BEAS-2B и A549, обработанных различной дозой (9,5 и 19 мкг / мл в течение 48 часов). (H) Экспрессия ACE-2 и TMPRSS2 в клетках VeroE6, обработанных бромелайном (75 мкг / мл) плюс E-64 (4 мкМ). β-Актин и GAPDH служили в качестве контроля нагрузки. (I) Максимальные единицы резонанса SPR (RSU) в равновесии как функция концентрации контрольного RBD и S-эктодомена с использованием иммобилизованного ACE-2. S-эктодомен-eGFP, очищенный из клеток Tni насекомых, показал молекулярную массу ~ 215 кДа (намерение; 1, фиктивный контроль; 2, S-эктодомен-eGFP). (J) Luminex-анализ средней интенсивности флуоресценции (MFI) S-эктодомена с положительным COVID-19 (n = 6) и отрицательные ( n = 6) образцы пациентов.
S-эктодомен содержит 30 цистеиновых аминокислот с 15 стабилизирующими дисульфидными связями (UniProtKB: P0DTC2) (рис.  2A ). Один только домен RBD имеет девять остатков цистеина, восемь из которых образуют четыре дисульфидные связи. Бромелайн индуцировал зависимое от дозы и времени расщепление S-эктодомена в супернатанте Tni клеток насекомых (Рис.  2B и C ) и очищенном S-эктодомене (Рис.  2D ). Инактивация нагреванием и обработка ингибитором цистеиновой протеиназы (E-64) ингибировали опосредованное бромелайном переваривание S-эктодомена (рис.  2E и F ). Кроме того, SARS ‐ CoV ‐ 2 с лечением бромелайном показал потерю белка Spike на вирусной поверхности (рис.  2G.). Наши исследования стыковки гомотримерного (содержащего RBD цепи A) белка S и стволового бромелаина показали, что бромелайн расщепляет S-белок с одинаковой вероятностью по дисульфидным связям 131–166 (50,4%) и 617–649 (49,6%) (рис.  2H ). . Хотя каталитический сайт напрямую не задействован, белок-белковая стыковка помещает фермент в непосредственной близости от этих связей. Эти результаты демонстрируют, что активность цистеиновой протеазы бромелайна ответственна за расщепление ACE-2 и S-белка SARS-CoV-2 клеток-хозяев.
образФИГУРА 2Открыть в программе просмотра рисунковСиловая установкаБромелайн расщепляет S-эктодомен SARS ‐ CoV ‐ 2. (A) Схематическое изображение предполагаемого положения аминокислоты цистеина и дисульфидных мостиков в S-эктодомене SARS-CoV-2. (B и C) Иммуноблоттинг S-эктодомена в супернатанте Tni-клеток насекомых, обработанных бромелайном, в различной дозе (5, 10, 15, 20 и 25 мкг / мг общего белка) и времени (25 мкг / мг общего белка на 10 дней). –60 мин) соответственно. (D) Иммунологическое исследование очищенного S-эктодомена, обработанного бромелайном (соотношение 1:10), в течение 30, 60, 120 и 240 минут. (E и F) Иммунопробирование S-эктодомена в инактивированном нагреванием бромелаине (80 ° C / 8 мин) и бромелаине (25 мкг / мг общего белка) плюс супернатант Tni, обработанный E-64 (1, 2 и 4 мкМ) соответственно. Окрашенные SimplyBlue изображения геля супернатанта Tni, обработанного бромелайном, служили в качестве контроля загрузки. (G) ЭМ трансмиссии с отрицательным окрашиванием обработанного бромелайном (250 мкг / мл, при 37 ° C для 1. 5 ч) SARS ‐ CoV ‐ 2. Вирусные частицы, обработанные контрольным носителем (слева) и бромелайном (справа). Масштабная шкала = 100 нм. Эксперименты проводились трижды, и представлено репрезентативное изображение. (H) Типичная конформация бромелайна (желтый и пурпурный), состыкованная с белком S (зеленый) рядом с дисульфидом 131–166 (вверху слева; при более близком изображении вверху справа) и 617–649 (внизу слева; при близком рассмотрении внизу справа) мост...

Продолжение: https://www.facebook.com/veniamin.zaycev/posts/4520464154654975

Error

Anonymous comments are disabled in this journal

default userpic

Your reply will be screened

Your IP address will be recorded