Нейроинвазия SARS-CoV-2 в мозг человека и мыши

Хотя COVID-19 считается в первую очередь респираторным заболеванием, SARS-CoV-2 поражает несколько систем органов, включая центральную нервную систему (ЦНС). Тем не менее, нет единого мнения о последствиях инфекций ЦНС. Здесь мы использовали три независимых подхода для проверки способности SARS-CoV-2 инфицировать мозг. Во-первых, используя органоиды головного мозга человека, мы наблюдали явные доказательства инфекции с сопутствующими метаболическими изменениями в инфицированных и соседних нейронах. Однако не было обнаружено никаких доказательств ответа интерферона типа I. Мы демонстрируем, что инфекцию нейронов можно предотвратить, блокируя ACE2 антителами или вводя спинномозговую жидкость от пациента с COVID-19. Во-вторых, используя мышей со сверхэкспрессией человеческого ACE2, мы демонстрируем нейроинвазию SARS-CoV-2 in vivo. Наконец, при вскрытии трупов пациентов, умерших от COVID-19, мы обнаруживаем SARS-CoV-2 в нейронах коры и отмечаем патологические особенности, связанные с инфекцией с минимальными инфильтратами иммунных клеток. Эти результаты свидетельствуют о нейроинвазивной способности SARS-CoV-2 и о неожиданных последствиях прямого заражения нейронов SARS-CoV-2.

На сегодняшний день исследования аутопсии человека выявили транскрипты вирусной РНК в тканях мозга ( Puelles et al., 2020 ; Solomon et al., 2020 ) и вирусные белки в эндотелиальных клетках обонятельной луковицы ( Cantuti-Castelvetri et al., 2020 ) у людей, заболевших COVID-19. Появилось несколько отчетов, указывающих на инфицирование SARS-CoV-2 клеток центральной нервной системы (ЦНС) ( Bullen et al., 2020 ; Jacob et al., 2020 ;Пеллегрини и др., 2020 ; Рамани и др., 2020 ; Ян и др., 2020 ; Zhang et al., 2020 ). Тем не менее, остается много неизвестного относительно частоты или последствий нейроинвазии. Понимание всей степени вирусной инвазии имеет решающее значение для лечения пациентов, поскольку мы начинаем пытаться выяснить долгосрочные последствия COVID-19, многие из которых, по прогнозам, могут иметь возможное поражение ЦНС ( De Felice et al., 2020 ; Heneka et al., 2020 ; Pereira, 2020 ; Zhang et al., 2020 ).
Поскольку ЦНС не является основным органом, пораженным SARS-CoV-2, изучение неврологических заболеваний у пациентов с COVID-19 систематически сопряжено с несколькими проблемами, в том числе с наличием только части популяции пациентов с нейроинвазией, отсутствием технологий для непосредственного отбора образцов тканей ЦНС, и различение прямой нейроинвазии и системной виремии в головном мозге. Следовательно, для ответа на вопросы, лежащие в основе невропатологии SARS-CoV-2, необходимы надежные и надежные модельные системы. Во время пандемии вируса Зика (ZIKV) несколько групп использовали органоиды головного мозга человека, чтобы ответить на ключевые вопросы, касающиеся нейроинвазии ZIKV и ее последствий ( Garcez et al., 2016 ; Qian et al., 2016 ; Xu et al., 2019 ). Используя аналогично хорошо охарактеризованную модель органоидов человеческого мозга (Ланкастер и Кноблих, 2014 ; Lancaster et al., 2013 ), мы проверяем инфекционную способность SARS-CoV-2 в ткани ЦНС. Используя секвенирование одноклеточной РНК (RNA-seq), мы раскрываем транскрипционные изменения, вызванные заражением нейронов SARS-CoV-2.
Помимо нейроинвазивного потенциала SARS-CoV-2, остается вопрос, является ли ACE2 основным путем проникновения SARS-CoV-2 в нейрональные клетки и какие стратегии могут блокировать вирусную инфекцию. Экспрессия ACE2 в ЦНС, и в нейронах в частности, все еще неясна ( Xia and Lazartigues, 2008 ). Более того, в дополнение к ACE2, другие кофакторы, такие как TMPRSS2 ( Hoffmann et al., 2020 ) и Neuropilin-1 ( Cantuti-Castelvetri et al., 2020 ; Daly et al., 2020 ), по-видимому, влияют на частоту инфицирования, но это не так. неясно, необходимы ли они также для нейрональной инфекции. Таким образом, мы использовали профили транскрипции вместе с исследованиями блокирующих антител, чтобы продемонстрировать потребность в спайковом белке ACE2 и SARS-CoV-2 для инфицирования нейронов.
Чтобы получить актуальность для этих результатов in vivo, мы исследуем нейроинвазивный потенциал SARS-CoV-2 с использованием мышиных моделей SARS-CoV-2 и наблюдаем ремоделирование сосудов в инфицированных регионах, независимо от сосудистой инфекции, что является ценным инструментом, который может быть используется для анализа последствий инфекции ЦНС. Наконец, исследуя посмертные ткани мозга пациентов с COVID-19, мы предоставляем доказательства нейроинвазии SARS-CoV-2 и выявляем связи между инфекцией и ишемическими инфарктами в локализованных областях мозга.
Полученные результаты
Моделирование нейроинвазии и гибели клеток SARS-CoV-2 с использованием органоидов головного мозга человека
Чтобы проанализировать способ и последствия инфекции, мы сначала установили нейроинвазивный потенциал SARS-CoV-2 в модельной системе человеческого мозга. Мы использовали индуцированные человеком линии плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) (Y1 и Y6), полученные от здоровых людей ( рис. 1 ), для создания специфичных для переднего мозга клеток-предшественников нейронов человека (hNPCs). В культуре мы наблюдали репликацию SARS-CoV-2 в 2-недельных hNPC с пиковыми вирусными титрами уже через 12 часов после инфицирования (hpi; рис. S1, A и B ). Кроме того, окрашивание, опосредованное Tdt dUTP-биотином с меткой ник-концов (TUNEL), указывает на повышенную гибель клеток ( фиг. S1 A ). Затем мы сгенерировали органоиды мозга на основе hiPSC ( Amin and Paşca, 2018 ; Pellegrini et al., 2020 ;Qian et al., 2016 ; Velasco et al., 2019 ) для моделирования инфекции нейрональных клеток SARS-CoV-2 в 3D. Мы подтвердили дорсальную кортикальную идентичность органоидов с помощью иммуноокрашивания на маркеры FOXG1, PAX6 и CTIP2 ( рис. S2 C ). Подобно недавнему отчету ( Ramani et al., 2020 ), мы наблюдали инфицирование нейрональных клеток в органоидах 9-недельного возраста уже через 24 часа на дюйм, при этом значительно увеличилось количество SARS-CoV-2-позитивных клеток на 96 часах на дюйм ( Рис. 2, A – C и Рис. S1 C ). Хотя большинство клеток, инфицированных SARS-CoV-2, были локализованы в MAP2-положительных клеточных полях зрелых нейронов ( рис. 2 B [2] и рис. S1 C).), мы также наблюдали инфицирование SOX2-положительных нервных стволовых клеток с биполярной морфологией и клетками, локализованными вокруг структур, подобных нервной трубке ( Fig. 2 B [1]). Мы наблюдали увеличение количества SARS-CoV-2-позитивных клеток на 96 hpi по сравнению с 24 hpi ( рис. 2 C и рис. S1, C – E ). 96 hpi, мы наблюдали широко распространенную инфекцию, в основном ограниченную областями с высокой плотностью кортикальных клеток в органоиде ( рис. 2 D ). С помощью электронной микроскопии мы визуализировали вирусные частицы внутри органоида ( рис. 2 E ) с дискретными областями скопления вируса высокой плотности ( рис. 2 E [1]) и другими участками, показывающими почкование вируса из ER-подобных структур ( рис. 2 E[2–4]), предполагая, что SARS-CoV-2 способен использовать аппарат нейрональных клеток для репликации. Органоидная инфекция привела к обширной гибели нейрональных клеток; Поразительно, однако, что большинство TUNEL-положительных клеток были отрицательными по SARS-CoV-2 ( рис. 2, F и G ; и рис. S1 F ), и только около 15% клеток, инфицированных SARS-CoV-2, были TUNEL положительный ( рис. 2 H ). Повышенная гибель клеток коррелировала с более высокой плотностью SARS-CoV-2-позитивных клеток ( рис. 2 I ), которые, однако, не умирали открыто ( рис. 2, G и H ). Даже в пределах одной плоскости мы заметили, что область с высокой плотностью SARS-CoV-2 имеет больше TUNEL-положительных клеток ( рис. 2J , желтый прямоугольник) по сравнению с областями с низкой плотностью SARS-CoV-2 (Рис. 2 J , белое поле). Вместе эти данные показали, что SARS-CoV-2 может инфицировать клетки нервного происхождения, и предположили, что инфицированные клетки могут способствовать гибели ближайших клеток.
Профилирование органоидов человеческого мозга на уровне отдельных клеток

Продолжение: https://www.facebook.com/veniamin.zaycev/posts/4492409904127067