budetlyanin108 Вениамин Зайцев (budetlyanin108) wrote,
budetlyanin108 Вениамин Зайцев
budetlyanin108

Categories:

COVID-19. Тесты. ОТ-ПЦР. Ликбез

ЛИКБЕЗ

Сегодня у нас тред от коллеги из шведской лаборатории по секвенированию геномов О.Петтерссон, т.к. она просто простудилась, а не подхватила коронавирус, она согласилась рассказать про тесты ПЦР.

Очень много вопросов. Какие тесты? Почему не хватает? Какая чувствительность? Сколько занимают по времени?
Для начала отмечу, что тест на вирус это не тест на беременность. Он занимает время и требует специального оборудования. Все по порядку.

Образцы для тестов обычно берут ватным тампоном (swab), довольно глубоко из носовой или ротовой полости. Иногда берут мазок со слизистой щеки или образец слюны. В больнице могут взять и другие образцы, типа мокроты, кала, итд. Иногда берут кровь.
Теперь, что и зачем.
Мазок берут для диагностики, это самый распространенный вид сбора образцов, его на коронавирус берут всегда.
Мокроту или образцы из нижних дыхательных путей - иногда, для подтверждения диагноза у пациента в интенсивке.
Кал чаще всего берется для исследований, узнать сколько вирусных частиц выходят из организма этим путем.
Из всех этих образцов выделяют вирусную РНК.

Кровь - для переболевших, подтвердить что человек перенес болезнь. В плазме живого вируса нет, зато есть приобретенные к нему антитела. Такие тесты сейчас делают в Китае, в Европе такие тесты сейчас либо находятся в разработке, либо уже начинают выпускаться.
Вчера США зарегистрировали один такой тест.
Теперь КАК.
Итак, есть у нас ватный тампон. Его кладут либо в пластиковый кармашек, либо в пробирку, все маркируется и отвозится в лабораторию. Лаборант отрезает тампон от палочки и кладет его в буферный раствор. Что есть на тампоне?
Суп, в основном состоящий из наших клеток, наших родных микробов, и, само собой, вируса. Раствор отделяет все клетки и частички от ватки, и растворяет оболочки клеток и вирусные скафандры. Это надо делать в спец. лаборатории, т.к. до добавления раствора вирус заразен.
После того, раствор переносят в другую пробирку и добавляют белки, которые переводят РНК в ДНК (15-30 минут).

Тут начинаются различия между методами.

На полученный суп из разных ДНК можно сделать простой тест ПЦР
В роли затравки в ПЦР - два кусочка ДНК, тождественные 1 или 2 белковым протеинам.

Да, вирус постоянно мутирует, но некоторые участки его генома очень консервативны. Вот их и используют для затравок (праймеров).
Если в результате ПЦР на геле видна полоска, то диагноз подтвержден.

Простой тест ПЦР быстр (15-30 мин на подготовку и раскапывание, 45-60 мин сам тест + 30-45 мин на форез) и дешев, а ПЦР аппараты широко распространены.
Но чувствительность такого теста несколько сотен копий вируса на пробирку.

Намного более точна квантитативная ПЦР (или ПЦР реального времени, qPCR). Для определения вируса добавляют множество разных затравок и флуорофор. Тут не делают гель и ищут полоски. Спец. камера и компьютер в машине определяет все копии вирусных генов, т.к. они флуоресцируют.(фото1)
Чувствительность qPCR в разы выше чем простой ПЦР (несколько копий на пробирку, около 98-99%). Но она дороже, и аппараты могут быть не в каждой больнице. Особенность - тест не просто позитивен или негативен, он еще и квантитативен, т.е. можно определить вирусную нагрузку.
ПЦР и qPCR аппараты бывают на 8-24-48-98-384 пробирки.
Имеем: 15-30 мин на выделение РНК, 30-45 мин на перевод РНК в ДНК, 30-45 минут смешать реагенты и раскапать их по пробиркам, 1 час сделать ПЦР. Это МИНИМУМ 3 часа.
За раз, сделать 24 или 48 пробирок можно, но устанет рука (наделала сотни, если не тысячи таких в аспирантуре, на своей шкуре знаю). Профессиональное заболевание лаборантов-молекулярщиков - тендонит,
он же воспаление связок большого пальца правой руки, или хроническая боль в грудном отделе позвоночника. Руки ж постоянно навесу.

Большой объем тестов делают не в пробирках, а в специальных кюветах (microtiter plates), на 96 или 384 образца.(фото2)
Есть хитрые пипетки которыми можно готовить 8 образцов параллельно. Есть лабораторные роботы, которые могут сильно облегчить работу лаборанта. Их используют с ПЦР аппаратами на 96-384 образцов. Все это стоит немало.(фто3)
Практически во всем мире для диагностики Covid-19 наиболее широко применяется именно метод qPCR, причем с множественными затравками, т.к. она минимум в 10 раз более чувствительна чем любой другой тест.
Множественные затравки нужны чтобы поймать максимальное количество генов вируса, не смотря на возможные мутации.

Есть и более быстрые тесты на основе ПЦР, где вирус определяется уже на стадии перевода его с РНК в ДНК. Но там выше погрешность.
Можно делать ПЦР даже не выделяя РНК, просто на растворе с ватки. Но опять, высока погрешность.

Ученые из Китая и наши, стокгольмские, разработали тест LAMP. Это подвид ПЦР, но намного проще.
Вкратце, если тест положительный, то меняется цвет реакции. У нас такие тесты, надеюсь, скоро поставят на поток.
Есть и другие методы. Один из них - ИМБ, или иммуноблот. Из образца выделяют все белки, их денатурируют, разгоняют в электрофорезе, переносят из геля на мембрану, ее обрабатывают пробами (антителами) на нужный белок вируса, красят, а потом фотографируют.
Есть пятно - есть реакция = есть вирус.
Чувствительность ИМБ максимум 60%.

Сам ИМБ я никогда не делала, но делала его двоюродного брата, т.н. блот Саузерна. Возни минимум на три дня. Не знаю, может его улучшили и ускорили, врать не буду.
Есть и экспресс тесты, одна или две полоски. Но ни один из них официально не зарегистрирован, т.к. их чувствительность до конца не исследована. В данный момент используется только в Китае. Предполагаемая чувствительность 89%.
Эти тесты занимают 15 минут, для них достаточно капли крови. Однако, это не тест на вирус! Это тест на наличие инфекции в теле, причем любой, т.к. определяется уровень иммуноглобулина в крови.

С видами тестов разобрались. Золотой стандарт в мире - qPCR.
Почему их не хватает?
В тест входят:
- особая ватка на палочке (не абы какая, не на любой палочке)
- раствор для выделения РНК
- набор реагентов для синтеза ДНК из РНК
- затравки и реагенты для ПЦР или qPCR
- собственно qPCR аппарат

Все компоненты закупаются у разных компаний, и практически никогда не продаются полным набором.

Сейчас весь мир кинулся закупать ватки, растворы и прочие реагенты. В первые недели пандемии, простейшие наборы реагентов стали жутким дефицитом...
но сейчас, похоже, их производство наладили.

К тому плюсуем наличие обученного персонала и ПЦР аппаратов большой мощности.
Т.е. образцов-то оно много, но их еще надо успеть обработать, и не неделю, а БЫСТРО, желательно в течение дня.
В чем еще могут быть проблемы с тестами. Основные >
А) Ложные отрицательные, даже у чувствительных ПЦР. Тут проблема в том, что иногда не получается полностью растворить бактериальные клетки после переноса их из мазка.

Остатки клеточных оболочек могут снизить эффективность перевода РНК в ДНК, а так же чувствительность ПЦР. Тут крайне важна методика и хорошие реагенты.
Ложные положительные. Это когда фрагменты откопипащенной ДНК начинают витать в воздухе в виде аэрозоля. Они для нас безвредны, но могут осесть на пробирках, буферных растворах, пипетках, итд.
Чтобы этого избежать, всегда используется негативный контроль (чистая вода). Если в пробирке с водой находят вирусные гены, то тесту верить нельзя и нужно выкидывать все открытые реагенты и санировать аппаратуру.
Какие тесты делают в России у меня спрашивать бесполезно, я просто не знаю.

Зная общее положение дел, могу предположить что qPCR аппараты есть далеко не везде.
Вот, вкратце, все что нужно знать о тестах на коронавирус на данный момент.
Спасибо Ольге за хороший тред по тестам! Здоровья и не заболеть!

Добавлю по нашим тестам.

Существуют разные стратегии борьбы с эпидемией. Одна из них, успешно применяется в Ю.Кореи, в Сингапуре и Исландии, предполагает раннюю диагностику COVID-19, изоляцию больных и лечение.
Очевидно, что при существующем качестве диагностики у нас осуществление этой стратегии вряд ли способно дать результат. Вероятно, поэтому принято решение о финансировании разработки и совершенствовании имеющихся отечественных тест-систем.
В условиях проведения диагностики тестами с низкой чувствительностью нет смысла искажать статистику. Невысокая результативность тестирования – не показатель низкой распространенности COVID-19 в России, а признак недостаточного качества диагностики.

P.S. Вот нашел его! Уже в работе, только недавно про него писал, а он уже тестирует!
Работает методом изотермической амплификации (амплификация РНК с постоянной температурой), такие используются на новых машинах Abbott (фото4), могут усиливать и обнаруживать РНК SARS-CoV-2 за 5-13 минут.
Фото:

https://www.facebook.com/veniamin.zaycev/posts/3692269027474496
Tags: Ковид-19.4 Тесты
Subscribe

Recent Posts from This Journal

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

  • 0 comments